Análisis de la activación del NLRP3 en miofibroblastos conjuntivales cultivados bajo condiciones in vitro de ojo seco

Alumno investigador: Elena Xinmu Vallelado Vega

Departamento o Instituto Universitario: Instituto de Oftalmobiología Aplicada (IOBA).

Tareas realizadas:

1. Cultivo y tratamiento de células epiteliales conjuntivales.

Se cultivaron células epiteliales conjuntivales humanas inmortalizadas (IM-HConEpiC, Innoprot P10870-IM), las cuales fueron sometidas a condiciones hiperosmolares (500 mOsM) o inflamatorias (TNF-α, 25 ng/ml) durante 4 horas, simulando un ambiente de ojo seco. Posteriormente, los estímulos fueron retirados y las células se incubaron durante 24 horas adicionales en medio sin suplementos, recolectando el secretoma resultante. Se obtuvo igualmente el secretoma correspondiente de células epiteliales conjuntivales no tratadas que se utilizaron como control.

2. Estimulación de fibroblastos conjuntivales.

Se cultivaron fibroblastos conjuntivales humanos (HConF, Innoprot P10876), que fueron posteriormente estimulados durante 6 horas con el secretoma obtenido de las células epiteliales tratadas previamente. Esta estimulación buscó inducir la expresión génica del inflamasoma NLRP3, cuya expresión era el objeto del estudio. Se mantuvieron como control fibroblastos cultivados 6h con su propio medio de cultivo (en ausencia de ningún estímulo) así como fibrobalstos estimulados con el secretoma de células epiteliales conjuntivales no tratadas.

3.        Extracción y análisis de ARN.

Se extrajo y cuantificó el ARN total de ambos tipos celulares tras los tratamientos descritos.

4.        Cuantificación de la expresión génica de NLRP3 mediante RT-PCR.

Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcriptasa inversa en tiempo real para cuantificar la expresión del gen NLRP3. A partir del ARN extraído, se sintetizó ADN complementario mediante retrotranscripción utilizando kits comerciales adecuados para su posterior análisis. Posteriormente se realizó la PCR para el gen NLRP3 en un equipo de RT-PCR en tiempo real, utilizando GAPDH como gen de referencia. Se obtuvieron los valores de CT correspondientes y se aplicó el método 2^– ΔΔCt para comparar las diferencias relativas de expresión del gen NLRP3 entre los distintos grupos de tratamiento.

5.        Análisis estadístico de los resultados.

Los datos obtenidos se analizaron utilizando el programa GraphPad Prism. Se expresaron como media ± error estándar. Para determinar la significancia estadística se aplicó la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos. Se consideraron significativos los valores de p menores a 0,05.

Objetivos alcanzados:

A lo largo del proyecto se completó el análisis de la expresión de NLRP3 empleando técnicas de RT-qPCR en ambos tipos celulares, tanto epiteliales como fibroblastos conjuntivales en los distintos tratamientos a los que fueron sometidas, lo que permitió establecer comparaciones entre las respuestas de células epiteliales y fibroblastos ante los distintos tratamientos que simulan la enfermedad de ojo seco.

En las células epiteliales conjuntivales se observó un aumento significativo tanto con los estímulos inflamatorios (p < 0.001) como con los estímulos
hiperosmolares (p < 0.01). Lo que sugiere una activación del inflamasoma.
Sin embargo, la expresión de NLRP3 en los fibroblastos conjuntivales no se incrementó significativamente al ser tratados con el medio condicionado derivado de las células epiteliales estresadas. Por lo tanto, los mecanismos de señalización paracrina involucrados podrían ser más complejos o depender de factores adicionales que no están representados en nuestro modelo in vitro.

Sectores de aplicación:

Los resultados de esta investigación tienen aplicación en diversos ámbitos. En investigación biomédica, aportan conocimientos clave sobre los mecanismos moleculares del ojo seco. En oftalmología clínica, pueden ayudar a identificar biomarcadores como NLRP3 para el diagnóstico y tratamiento personalizado. A nivel terapéutico, abren la puerta al desarrollo de nuevas estrategias antiinflamatorias dirigidas al inflamasoma. Finalmente, en el sector farmacéutico y biotecnológico, ofrecen oportunidades para el diseño de fármacos y modelos celulares aplicables en ensayos preclínicos.

Metodología utilizada:

Se realizó un estudio experimental in vitro para investigar la activación del inflamasoma NLRP3 en miofibroblastos conjuntivales humanos bajo condiciones que simulan la enfermedad de ojo seco.

Para realizar este estudio se realizaron cultivos celulares (HConEpiC, Innoprot P10870-IM y HConF, cultivo primario, Innoprot P10876), extracción (RNeasy Micro Kit) y cuantificación (Qubit RNA HS Assay Kit) de ARN, ensayos de PCR (iScript cDNA Synthesis Kit y SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix) y el análisis estadístico de los datos obtenidos.

Opinión sobre la experiencia investigadora desarrollada:

La experiencia investigadora ha sido muy enriquecedora tanto a nivel académico como personal. La participación activa en todas las fases del trabajo experimental desde el cultivo celular hasta el análisis de expresión génica y el tratamiento estadístico de los datos me ha permitido consolidar los conocimientos teóricos adquiridos durante el grado y desarrollar habilidades prácticas esenciales en el ámbito de la biomedicina.

Además, desenvolverme en un entorno de investigación ha facilitado mi integración en un equipo de trabajo, fortaleciendo el desarrollo de competencias transversales como la organización, la comunicación científica y la resolución de problemas. El contacto directo con técnicas avanzadas de biología molecular, como la RT-qPCR, ha sido especialmente valioso para adquirir experiencia en metodologías clave en investigación traslacional.

Finalmente, el enfoque del proyecto, centrado en un problema clínico de gran relevancia como la enfermedad del ojo seco, ha reforzado mi interés por la investigación orientada a la mejora de la calidad de vida de los pacientes y la búsqueda de soluciones innovadoras desde la ciencia básica.